El síndrome respiratorio agudo severo, conocido como enfermedad COVID-19 (debido al virus SARS-CoV-2), se transmite a través de gotículas respiratorias y contacto cercano.[1] La incidencia de la COVID-19 fue extremadamente grave en Lombardía y el valle del Po (norte de Italia),[2] una zona caracterizada por altas concentraciones de partículas contaminantes, conocidas por sus efectos negativos en la salud humana.[3] Las cifras regionales disponibles para Italia al 12 de abril muestran que aproximadamente el 30 % de las personas con resultado positivo residían en Lombardía (alrededor del 40 % si se consideran todos los casos confirmados desde el inicio de la epidemia), seguida de Emilia-Romaña (13,5 %), Piamonte (10,5 %) y Véneto (10 %).[2] Estas cuatro regiones del valle del Po concentran el 80 % del total de fallecimientos registrados en Italia y el 65 % de los ingresos en unidades de cuidados intensivos.[2]
Una investigación realizada por la Escuela de Salud Pública de Harvard parece confirmar una asociación entre el aumento de las concentraciones de PM y las tasas de mortalidad por COVID-19 en EE. UU.[4] En comunicaciones anteriores, hemos planteado la hipótesis de que el virus SARS-CoV-2 podría estar presente en las partículas en suspensión (PM) durante la propagación de la infección,[5,6] en consonancia con la evidencia ya existente.
disponible para otros virus.[7-15] Sin embargo, el tema del microbioma asociado a las PM en el aire, especialmente en entornos urbanos, sigue estando en gran medida poco investigado,[16] y, en la actualidad, nadie ha llevado a cabo estudios experimentales específicamente destinados a confirmar o excluir la presencia del SARS-CoV-2 en las PM.
Aquí presentamos los primeros resultados de los análisis que hemos realizado sobre 34 muestras de PM10 de partículas PM10 en el aire/exteriores de un emplazamiento industrial de la provincia de Bérgamo, recogidas con dos muestreadores de aire diferentes durante un período continuo de 3 semanas, del 21 de febrero al 13 de marzo.
Siguiendo la metodología descrita por Pan et al. en 2019 (para la recolección, medición del tamaño de partículas y detección de virus en el aire),[17] se recolectaron muestras de PM en filtros de fibra de cuarzo mediante un muestreador gravimétrico de aire de bajo volumen (38,3 l/min durante 23 h), conforme al método de referencia EN12341:2014 para la monitorización de PM10. Las partículas se retuvieron en filtros con una eficiencia típica del 99,9 %.La muestra, debidamente almacenada y entregada al laboratorio de Genómica Aplicada y Comparativa de la Universidad de Trieste, se sometió a retención de aerosoles. Dada la naturaleza ambiental de la muestra, presumiblemente rica en inhibidores de las ADN polimerasas, procedimos a la extracción de ARN utilizando el kit Quick RNA para microorganismos del suelo fecal, adaptado al tipo de filtros.[18] Se enrolló la mitad del filtro, con la parte superior hacia adentro.En un tubo de polipropileno de 5 ml, junto con las perlas proporcionadas en el kit, se obtuvieron aproximadamente 400 µl de solución a partir del 1 ml inicial de tampón de lisis. Esta solución se procesó según los protocolos estándar, obteniéndose un eluato final de 15 µl. Posteriormente, se utilizaron 5 µl para la prueba de SARS-CoV-2. Debido al origen particular de la muestra, se empleó el kit qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix [19]. Los sistemas de amplificación fueron los del protocolo desarrollado por Corman et al., publicado en el sitio web de la OMS [20].
La prueba tenía como objetivo específico confirmar o descartar la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en partículas. El primer análisis utilizó el gen E como marcador molecular y arrojó un resultado positivo significativo en 15 de los 16 filtros, si bien, como era de esperar, el valor Ct se situó entre 36 y 38 ciclos.
Después de eso, replicamos el análisis en 6 de los filtros positivos (ya positivos para el “gen E”) utilizando el “gen RtDR” como marcador molecular – que es altamente específico para el SARS-CoV-2 – alcanzando 5 resultados significativos de positividad; también se realizaron con éxito pruebas de control para excluir falsos positivos (Fig. 1).
Para evitar el agotamiento del escaso material de muestreo disponible, el ARN extraído restante se envió al Hospital Universitario local (uno de los centros clínicos autorizados por el Gobierno italiano para las pruebas diagnósticas de SARS-CoV-2) para realizar una segunda prueba ciega paralela. Este segundo laboratorio clínico analizó 34 extracciones de ARN para los genes E, N y RdRP, e informó de 7 resultados positivos para al menos uno de los tres genes marcadores, confirmándose la positividad por separado para los tres marcadores (Fig. 2). Debido a la naturaleza de la muestra, y considerando que el muestreo no se realizó con fines de diagnóstico clínico sino para pruebas de contaminación ambiental (teniendo en cuenta también que los filtros se almacenaron durante al menos cuatro semanas antes de someterse a análisis genéticos moleculares), se decidió no utilizar muestras de ARN extraídas de forma aislada.Como consecuencia del confinamiento en Italia, podemos confirmar que hemos demostrado razonablemente la presencia de ARN viral del SARS-CoV-2 mediante la detección del gen RtDR, altamente específico, en 8 filtros. Sin embargo, debido a la falta de material adicional de los filtros, no pudimos repetir el número suficiente de pruebas para demostrar la positividad de los 3 marcadores moleculares simultáneamente.
Esta es la primera evidencia preliminar de que el ARN del SARS-CoV-2 puede estar presente en partículas en suspensión en el aire exterior, lo que sugiere que, en condiciones de estabilidad atmosférica y altas concentraciones de PM, el SARS-CoV-2 podría formar agregados con dichas partículas y, al reducir su coeficiente de difusión, aumentar la persistencia del virus en la atmósfera. Se requieren más estudios que confirmen esta evidencia preliminar.Se están recabando datos, que deberían incluir evaluaciones en tiempo real sobre la viabilidad del SARS-CoV-2 y su virulencia al adsorberse en partículas. Actualmente, no se puede establecer ninguna correlación entre la presencia del virus en las partículas y la progresión del brote de COVID-19. Otros aspectos que deben abordarse específicamente son las concentraciones promedio de partículas.necesario para un posible “efecto de refuerzo” del contagio (en caso de que se confirme que las PM pueden actuar como “portadores” de los núcleos de gotitas virales), o incluso la posibilidad teórica de inmunización como consecuencia de exposiciones a dosis mínimas en umbrales más bajos de PM.
Figura 1. Curvas de amplificación de los genes E (A) y RdRP (B): las líneas verdes representan los filtros analizados; las líneas cruzadas, los filtros de prueba.representa las extracciones del filtro de referencia; las líneas rojas representan la amplificación de las muestras positivas.
Figura 2. Resultados positivos (marcados con X) para los genes E, N y RdRP obtenidos en las 34 muestras de PM10.filtros probados en los segundos análisis paralelos.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Departamento de Química Industrial, Universidad de Bolonia, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bolonia, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Centro Interdepartamental de Investigación Industrial “Fuentes Renovables, Medio Ambiente, Crecimiento Azul, Energía”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Departamento de Biología, Universidad “Aldo Moro” de Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Departamento de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Trieste, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. División de Investigación Ambiental, TCR TECORA, Milán, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Departamento de Ciencias de la Vida – Universidad de Trieste, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. División de Medicina de Laboratorio, Hospital Universitario Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Sociedad Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Milán, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Departamento de Ciencias y Políticas Ambientales, Universidad de Milán, Milán, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autor correspondiente:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referencias
1. Organización Mundial de la Salud, Modos de transmisión del virus causante de la COVID-19: implicaciones para las recomendaciones de precaución de PCI, Informe científico; disponible en: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 de marzo de 2020)
2. Ministerio de Salud italiano, boletín diario sobre el brote de Covid-19 en Italia, disponible en http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. AEMA, Agencia Europea de Medio Ambiente, Informe sobre la calidad del aire en Europa 2019; n.º 10/2019; Agencia Europea de Medio Ambiente: Copenhague, Dinamarca, disponible en: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposición a la contaminación atmosférica y mortalidad por COVID-19 en Estados Unidos, disponible en: https://projects.iq.harvard.edu/files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Sociedad Italiana de Medicina Ambiental (SIMA), Documento de posición sobre partículas y COVID-19,
Disponible en: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is There a Plausible Role for Particulate Matter in the spreading of COVID-19 in Northern Italy?, BMJ Rapid Responses, 8 de abril de 2020, disponible en: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generación de partículas finas fecales (PM2.5) contaminadas con el virus de la influenza aviar (VIA): detección del genoma y la infectividad y cálculo de la inmisión. Microbiología Veterinaria. 139, 156-164 (2009)
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19. Quantabio Ltd, descripción del producto, disponible en: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK y Mulders, DG (2020).
Detección del nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR en tiempo real. Eurosurveillance, 25(3), disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Original: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Fecha de publicación: 18 de abril de 2020
